固相萃取法用于豬肉中磺胺類藥物多殘留的測定

1 前言 近年來，越來越多的研究結(jié)果表明，磺胺類藥物特別是磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、 磺胺甲基異惡唑等殘留對人體的危害主要表現(xiàn)為“致癌、致畸、致突變”作用，引起過敏、 中毒和導(dǎo)致耐藥性菌株產(chǎn)生，以及引起造血系統(tǒng)障礙、急性溶血性貧血、粒細胞缺乏癥、再 生障礙性貧血等。因此，加強磺胺殘留的檢測及監(jiān)控是控制獸藥殘留發(fā)生的重要措施之一。

2 儀器與試劑

2.1 儀器 SPE400 全自動機械臂固相萃取儀；高效液相色譜儀；絞肉機；均質(zhì)機；離心機；旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀；濾膜（有機相，0.22μm）

2.2 試劑及耗材 乙酸乙酯（色譜純）、鹽酸溶液（0.1mol/L）、正己烷、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜 純）、甲酸（色譜純）、氨水 MCX 固相萃取柱，3ml，填充物 60mg 50%甲醇乙腈溶液：取甲醇 50mL，用乙腈溶液并稀釋至 100mL 氨化甲醇洗脫液：取氨水 5mL，用甲醇溶解并稀釋至 100mL 0.1%甲酸溶液：取甲酸 1mL，用水溶解并稀釋至 1000mL 0.1%甲酸乙腈溶液：取 0.1%甲酸 830mL，用乙腈溶解并稀釋至 1000mL SPE-03-2019 07 2

3 實驗方法

3.1 實驗步驟

3.1.1 取樣 取適量新鮮或解凍的供試組織，采用絞肉機絞碎均質(zhì)后備用。

3.1.2 提取 稱取均質(zhì)好的試樣 5g 于聚四氟乙烯離心管中，加入乙酸乙酯 20mL，搖動 5min，將 試樣分散開，在 4000r/min 下離心 5min，取上層清液與 10mL 于錐形瓶中；殘渣中再加入 20 mL 乙酸乙酯，重復(fù)抽提一次，合并兩次提取液。

3.1.3 脫脂 在提取液中加 0.1mol/L 鹽酸溶液 4mL，于 40℃下蒸發(fā)至少于 3mL，轉(zhuǎn)入 10ml 離心管中。 用 0.1mol/L 鹽酸溶液 2mL 洗錐形瓶并轉(zhuǎn)至同一離心管中，再用正己烷 3mL 洗錐形瓶，再將 正己烷轉(zhuǎn)至同一離心管中，晃動離心管將其混合均勻，在 3000r/min 下離心 5min，棄去正己 烷。再次用正己烷 3mL 洗錐形瓶，轉(zhuǎn)至同一離心管中，搖晃離心管將樣品在溶劑中混合均勻， 在 3000r/min 下離心 5min，棄去正己烷。取下層液備用。 SPE-03-2019 07 3

3.1.4 固相小柱凈化 過程 試劑名稱 用量 速度 等待時間 空氣助推 次數(shù) 活化 甲醇 2mL 3mL/min 0s 2mL 1 鹽酸（0.1mol/L） 2mL 3mL/min 0s 2mL 1 上樣 2mL 1mL/min 0s 2mL 1 淋洗 鹽酸（0.1mol/L） 1mL 3mL/min 0s 2mL 1 甲醇乙腈（50%） 2mL 3mL/min 0s 2mL 1 洗脫 氨化甲醇 4mL 3mL/min 5s 2mL 1 將洗脫液于 40℃氮氣吹干，加 0.1%甲酸乙腈溶液 1mL 溶解殘余物，濾膜過濾，供高效 液相色譜測定。

3.1.5 色譜測定條件 色譜柱：C18 流動相：0.1%甲酸+乙腈 流速：1mL/min 柱溫：30℃ 檢測波長：270nm SPE-03-2019 07 4 進樣體積：100uL 流動相梯度洗脫條件 時間/min 0.1%甲酸/% 乙腈/% 0.0 83 17 5.0 83 17 10.0 80 20 22.3 60 40 22.4 10 90 30.0 10 90 31.0 83 17 48.0 83 17

3.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取 10ug/mL 磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用 0.1%甲酸乙腈溶液稀釋，配置成 濃度為 10、50、100、250、500、和 5000ug/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜測定。 以測得峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān) 系數(shù)。

3.1.7 測定 將樣品按照與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時相同的色譜條件進行測試，得到樣品色譜峰的峰面積。根 據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中磺胺類藥物的濃度。 SPE-03-2019 07 5

4 結(jié)果與討論

4.1 活化、上樣、淋洗步驟中所用到的試劑以設(shè)置的速度進入固相小柱后均可以以較快的速 度流出，無需設(shè)置等待時間，只需設(shè)置一較小體積的空氣助推將殘留在管路里的少量試劑完 全推出即可。

4.2 洗脫步驟里因洗脫液流出小柱較為緩慢需設(shè)置一段等待時間，以足量的洗脫液可以 充分將目標(biāo)物洗脫。

4.3 結(jié)論 用固相萃取法凈化豬肉中磺胺類藥物殘留的過程實現(xiàn)自動化，減少人力的消耗，實驗過 程中使用的有機溶劑采用密封處理，降低了對人體的傷害且儀器能的控制活化、上樣、 淋洗、洗脫等溶劑流速，使樣品凈化的更為充分。

參考文獻 [1] GB 29694-2013 食品安家標(biāo)椎 動物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定 高效液 相色譜法.

注意事項 樣品液蒸發(fā)至 2mL 左右轉(zhuǎn)移至 10mL 離心管后，需用國標(biāo)中規(guī)定的試劑充分洗滌錐形瓶， 并將洗液一同倒入離心管。經(jīng)提取和脫脂后備用的下層液約為 3mL 左右，將其從離心管轉(zhuǎn)至 樣品管后，需用 3mL 鹽酸溶液（0.1mol/L）對離心管進行潤洗，洗液一并倒入樣品管，供后 續(xù)凈化。